Главная страница
qrcode

Краткий курс


НазваниеКраткий курс
АнкорMetoda po mikre.doc
Дата30.11.2017
Размер0.68 Mb.
Формат файлаdoc
Имя файлаMetoda_po_mikre.doc
ТипДокументы
#28898
страница7 из 15
Каталогryazmeduniver

С этим файлом связано 83 файл(ов). Среди них: raspisanie_-_osen.pdf, Научно-практический семинар.doc, телесно-ориентированная.doc, Разрешение на прохождение практики (NB снизу пе...docx, 20 частых вопросов первокурсника.doc, Osen_1_lech_2012-2013_nov_plan_-36_gr.doc, коллок по шизе.doc, 1 марта в 17.docx и ещё 73 файл(а).
Показать все связанные файлы
1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   ...   15

Реакция нейтрализации токсина антитоксином (РН) - серологическая реакция между мик­робным экзотоксином и антителами, приводящая к инактивации ядовитого действия токсина. Её ставят в опытах на животных: для обнаружения экзотоксина в исследуемом материале; для опре­деления титра антитоксина в иммунной сыворотке. Например, материал, содержащий экзотоксин, смешивают с известной диагностической сывороткой (в избытке), выдерживают 30 мин и вводят животным. Если сыворотка нейтрализует токсин, отравления и гибели животных нет. Если токсин не соответствует антитоксинам сыворотки, животные погибают (как и в контрольной группе жи­вотных, получивших тот же материал без сыворотки). В обычной лабораторной практике данную реакцию используют для диагностики ботулизма. Для определения антитоксической сыворотки ставят такой же опыт, но берут стандартный экзотоксин известной, силы и смешивают с сыворот­кой в разных соотношениях. Определяют наименьшее количество сыворотки, нейтрализующее оп­ределенное число минимальных летальных доз-DLM токсина (это количество соответствует I ан­титоксической единице, АЕ сыворотки). Титр сыворотки выражают количеством АЕ или ME (международных антитоксических единиц) в I мл сыворотки. Например, I ME противодифтерий­ной сыворотки нейтрализует 100 DLM дифтерийного токсина для морской свинки.

Титрование антитоксических сывороток проводят и в пробирках - в реакции флоккуляции (разновидность РП). Оно основано на том, что при смешивании экзотоксина или анатоксина (т.е. белкового антигена) с титруемой сывороткой наиболее раннее помутнение (инициальная флокку-ляция) наблюдается в пробирке с эквивалентным соотношением токсина (анатоксина) и антиток­сина (т.е. I TE (Lf) : I АЕ (МЕ)).

Реакция иммунофлюоресценции (ИФ) - взаимодействие люминесцирующих антител с кор­пускулярным антигеном и образование светящегося иммунного комплекса. Метод основан на спо­собности иммуноглобулинов прочно соединяться с флюорохромами (ФИТЦ, акридиновым оран­жевым и др.) без потери специфичности. Под действием ультрафиолета флюорохромы дают вторичную люминесценцию.

В прямом методе ИФ на предметном стекле готовят и фиксируют мазок из антигенсодержащего материала, наносят на него люминесцирующую сыворотку (например, противочумные анти­тела, меченные ФИТЦ). После 30-минутного контакта препарат тщательно промывают и изучают под люминесцентным микроскопом. Клетки чумного микроба в исследуемом материале светятся по периферии желто-зеленым цветом. ИФ протекает в I фазу и обладает рядом достоинств: высо­кочувствительна, проста в постановке, может использоваться как метод экспресс-диагностики (ответ в течение 1-2 ч). Её используют для быстрого обнаружения микробов в исследуемом материа­ле, а также для их идентификации.

Непрямой метод ИФ отличается тем, что на стекло наносят обычные кроличьи антитела, ко­торые образуют с клетками невидимый комплекс АГ+АТ. Затем препарат промывают и обрабаты­вают люминесцирующей: сывороткой с ослиными (лошадиными) AT к кроличьему белку (образу­ется двойной светящийся комплекс). Этот метод более экономичен, т.к. используется одна люминесцирующая и набор нелюминесцирующих сывороток.

Иммуноферментный анализ (ИФА). Основан на использовании антител, меченных фермен­том, который проявляет в присутствии субстрата специфическую активность в случае образования комплекса антиген+антитело, фиксированного на твёрдой основе. ИФА широко используют для определения разнообразных антигенов и антител. Разработано много методов и модификаций ИФА, выпускаются коммерческие наборы. Для определения антигена в исследуемом материале (сэндвич-метод) вначале производят сорбцию известных антител на поверхности лунок полистиро­ловой пластины, затем вносят антигенсодержащий материал, и, после контакта, тщательно промывают. Затем в лунки добавляют соответствующие антитела (сыворотку), меченные пероксидазой хрена или другим ферментом, отмывают и добавляют хромогенный субстрат (5-аминосалициловую кислоту с перекисью водорода или др.).

При положительной реакции в течение 1 часа развивается коричневое окрашивание, интен­сивность которого зависит от количества меченных антител, связанных в иммунном комплексе. Для определения неизвестных антител (например, с целью серодиагностики сифилиса или ВИЧ-инфекции) на поверхности лунок сорбируют известный антиген, затем добавляют исследуемую сыворотку крови, промывают, вносят сыворотку с антителами против иммуноглобулинов челове­ка, меченную ферментом,и, после вторичной промывки, добавляет хромогенный субстрат. Учиты­вают так же. ИФА отличается высокой чувствительностью и специфичностью.

СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ

ПЦР. В настоящее время метод амплификации нуклеиновых кислот полимеразной цепной реакцией (ПЦР) широко используется в практической медицине. Основным достоинством метода ПЦР является чрезвычайно высокая чувствительность анализа - до 1 копии геномной ДНК возбу­дителя инфекции в исследуемой пробе до 100 копий генома в исследуемой пробе.

Возможности, заложенные в методе ПЦР, позволяют достигать максимальной специфичности анализа, т.е. способности выявлять ДНК конкретного инфекционного агента в присутствии ДНК других микроорганизмов и ДНК организма-хозяина. К настоящему времени метод автоматизиро­ван и позволяет, при необходимости, получать результаты анализа в течение одного рабочего дня.

ПЦР в настоящее время используется для: ранней диагностики инфекционных заболеваний у серонегативных пациентов, когда лечение наиболее эффективно; выявления персистирующих, ла­тентных и рецидивирующих форм инфекций; контроля эффективности лечения; диагностики оп­портунистических инфекций, часто протекающих на фоне иммунодефицита, вследствие чего по­становка диагноза только по результатам серологических исследований затруднена из-за имеющихся несоответствий между параметрами иммунного ответа и протёкания заболевания; раз­решения сомнительных результатов серологических исследований; эпидемиологических исследо­ваний; выявления наиболее патогенных штаммов инфекционных агентов; исследования инфекци­онности пулированных образцов крови и ее продуктов, применяемых в терапии.

Инфекционный агент: Вирус гепатита В, Вирус гепатита С, Цитомегаловирус, Вирус просто­го герпеса, Вирус Эпштейна-Барра. Герпес-вирус типа 6 (HHV-6), Хламидии (trachomatis). Уреа-плазмы (urealiticum), Микоплазмы (hominis), Трихомонас (vaginalis), Гонококки (Gonorrhoeae neisseria), Гарднерелла (vaginalis), Листерии (monocytogenes), Микобактерий (tuberculosis), ВИЧ, выявление мутации в гене CKR-5 и др.

Ход исследования:

На первой стадии при температуре 94°С (или выше) происходит денатурация двойной цепи исследуемой ДНК (стадия денатурации).

На второй стадии используют праймеры, строго специфичные к определенным участкам цепей исследуемой ДНК они связываются с этими участками ДНК (стадия отжига). На третьей стадии при температуре 70-72°С с участием термофильной ДНК-полимеразы проис­ходит синтез новых цепей ДНК. Инициация синтеза ДНК происходит в местах связывания праймеров с исследуемой ДНК, матрицей для синтеза служат исходные цепи ДНК (стадия полимери­зации).

Таким образом, за цикл, включающий три стадии, происходит удвоение каждой из двух цепей ДНК. При проведении 20 таких циклов теоретически происходит увеличение количества исходной ДНК в миллион и более раз. Образовавшийся специфический продукт ПЦР (ампликон) в подав­ляющем большинстве случаев детектируют методом электрофореза в агарозном или полиакриламидном гелях, сравнивая с контрольными образцами.

Для ПЦР-анализа РНК-содержаших инфекционных агентов предварительно проводят стадию обратной транскрипции - получения ДНK, комплементарной вирусной РНК-матрице, для чего ис­пользуют специфические праймеры к РНК и фермент - РНК-зависимую ДНК-полимеразу (обрат­ную транскриптазу). Далее ПЦР-анализ проводят по схеме, описанной выше.

Для ПЦР анализа используют разнообразный клинический материал: кровь, сыворотку крови, форменные элементы крови, мочу, слюну, соскобы и мазки со слизистых, ликвор, слезную жид­кость, содержимое везикул, биоптаты органов и тканей. Для исключения контаминации забор проб производят только одноразовым инструментарием (шприцы, соответствующие зонды, пробоот­борники и пр.). Взятый материал помещают в одноразовые пробирки (например, типа "Эппендорф") Для более эффективного использования результатов ПЦР-анализа врачами-клиницистами при постановке, подтверждении диагноза или контроле за лечением нами предложена следующая, система полуколичественной оценки результатов анализа: + - 50-500 копий геномов на пробу; ++ - 500-5000 копий геномов на пробу; +++ - 5000-50000 копий геномов на пробу; ++++ - более 50000 копий геномов на пробу;

ИММУНОБЛОТТИНГ

Качественный метод, позволяющий выявлять антигены и антитела в исследуемой пробе.

Для выявления антител:

Исследуемую сыворотку больного инкубируют с известными антигенами нанесенными на нитроцеллюлозную мембрану, затем добавляют меченную диагностическую сыворотку против иммуноглобулинов человека.

Для выявления антигена:

С помощью электрофореза разделяют белки в исследуемой пробе от больного, затем их пере­носят на нитроцеллюлозную мембрану и добавляют меченную диагностическую сыворотку против известных антигенов

Иммуноблоттинг широко применяется для подтверждения твердофазного иммуноферментного анализа.

ХАРАКТЕРИСТИКА НЕКОТОРЫХ РЕАКЦИИ ИММУНИТЕТА (РИ)

РИ

Направление исследования



Ингредиенты

Дополн.

ф-р

Феномен (учетный признак)

Антиген

Антитело

РА

1 .Серодиагностика

Корпускулярный

диагностикум

(взвесь клеток)

Агглютинины

сыворотки крови больного (Х)2

ИХН

Образование хлопьев агглютината

2.Идентификация

клеток

Взвесь микробных

или др. клеток (X)

Агглютинины диагностич. сыворотки

Тот же

Тот же

РПГА

1.Серодиагностика

Эритроцитарный

антигенный диагностикум

Агглютинины

сыворотки крови больного (Х)

Тот же

Образование рыхлого осадка эритроцитов

2.Индикация

антигена

Корпускулярный

или растворимый

Эритроцитарный иммуноглобулиновый

диагностикум

Тот же

Тот же

РП

Индикация

антигена

Прозрачный экстракт (X)

Преципитины

диагн. с-ки

Тот же

Выпадение

осадка

РН

1. Идентификация

токсина

Токсинсодер-

жащий экстракт (X)

Антитоксины

диагн. сыворотки

Тот же

Отсутствие

отравления и гибели животных

2.Определение

титра антитоксина

Препарат токсина

в известной дозе

Испытуемая сыворотка (X)

Тот же

Тот же

ИФ

Индикация

антигена

Корпускулярный

(Х)

Антитела, меченные флюорохромом

Тот же

Свечение

клеток при УФО

ИФА

1.Индикация

антигена

Корпускулярный

или растворимый

(X)

1 .Фиксированнные AT

2.АТ, меченные

ферментом пероксидазой

1. ИХН

2. 5-АСК

3. Н2Н2

Цветная

реакция




2.Серодиагностика

Фиксированный известный

1.Сыворотка больного (X) 2.Антиглобулиновые AT, меченные ферментом

Тот же

Тот же

МЕДИЦИНСКИЕ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРЕПАРАТЫ

Иммунобиологическими называют препараты, которые оказывают влияние на иммунную систему, действуют через иммунную систему или принцип действия которых основан на иммуно­логических реакциях, а так же препараты для нормализации состава аутомикрофлоры.

Иммунобиотехнология разработала к настоящему времени более 1000 иммунобиологических препаратов.

Различают следующие группы медицинских иммунобиологических препаратов (МИБП):

  • вакцины

  • лечебные сыворотки и иммуноглобулины

  • препараты из живых микроорганизмов или микробных продуктов (фаги, эубиотики, фер­менты)

  • иммуномодуляторы

  • диагностические препараты (диагностические сыворотки, диагностикумы, аллергены, бак­териофаги).

Действие МИБП может быть активным и пассивным, специфическим и неспецифическим.

Активное приводит к активации иммунной системы на выработку антител или клеточно-опосредованных реакций (например, при вакцинации).

Пассивное - к созданию иммунитета, минуя активацию иммунной системы (при введении готовых иммуноглобулинов).

Специфическое - если оно направлено против конкретного антигена (например, противо­гриппозная вакцина или противодифтерийная сыворотка).

Неспецифическое - приводит к активации иммунной системы и или факторов естественной резистентности в целом (например, активация фагоцитоза или пролиферация иммуноцитов под влиянием иммуномодуляторов).

Характеристика вакцинных препаратов

Классификация вакцин

Живые вакцины

Корпускулярные

инактивированиые

вакцины

Надмолекулярные вакцины

Молекулярные вакцины

Аттенуированные

Цельноклеточные



На основе протек-

тивных антигенов

(субъединичные и

субклеточные)


Биосинтетические (ана­токсины)


Дивергентные


Цельновирионные


Химически-

синтезированные антиге­ны


Векторные (рекомбинантные)

Генноинженерные


В настоящее время для профилактики инфекционных заболеваний применяют следующие вакцинные препараты:

1) Вакцины живые составляют примерно половину из всех применяемых в практике вакцин. Живые вакцины при введении в организм (обычно в дозе 1 тыс.-1 млн. клеток) приживаются, раз­множаются, вызывают вакцинальный процесс и формирование активного иммунитета против со­ответствующего возбудителя. Вакцины получают из аттенуированных вакцинных штаммов или из непатогенных для человека природных (дивергентных) штаммов, имеющих общие антигенные свойства с болезнетворными патогенными штаммами представляют собой взвеси выращенных на различных питательных субстратах вакцинных штаммов. Основным свойством живого аттенуированного штамма, используемого в производстве вакцин, является стойкая утрата вирулентности при сохранении способности вызывать иммунную реакцию, схожую с естественной. Вакцинный штамм размножается в организме хозяина и индуцирует клеточный, гуморальный, секреторный иммунитет, создавая защиту всех входных ворот инфекции. Главными преимуществами живых вакцин являются:

  • высокая напряженность, прочность и длительность создаваемого ими иммунитета;

  • возможность применения не только путем подкожного введения, но и другими, более про­стыми путями (накожно, перорально, интраназально).

Живые вакцины имеют ряд недостатков:

  • сложно комбинируются и плохо дозируются;

  • категорически противопоказаны людям, страдающим иммунодефицитом;

  • вызывают вакцинно-ассоциированные заболевания

  • относительно нестабильны;

  • естественно циркулирующий дикий вирус может тормозить репликацию вакцинного виру­са и снизить эффективность вакцины; это отмечалось в отношении вакцинных штаммов полиовируса, размножение которого может подавляться при инфицировании другими энтеровирусами.

В процессе производства, транспортировки, хранения и применения живых вакцин, на­ходимо строго соблюдать меры, предохраняющие микроорганизмы от гибели и гарантирующие сохранение активности препаратов (холодовая цепь).

В Российской Федерации живые вакцины широко применяют с целью специфической профи­лактики полиомиелита, кори, эпидемического паротита, гриппа, туберкулеза, чумы, туляремии, бруцеллеза, сибирской язвы.

2) Убитые вакцины (инактивированные) получают путем получаемые путем инактивации выращенных штаммов различными методами таким способом, который приводит лишь к минимальному повреждению структурных белков. Чаще всего с этой целью прибегают к мягкой обра­ботке формалином, фенолом, спиртом. Инактивируют нагреванием при температуре 56 С в тече­ние 2-х часов, УФ-лучами. Иммуногенность инактивированных вакцин ниже в сравнении с живыми, иммунитет менее напряженный и непродолжительный.

Убитые вакцины имеют следующие преимущества:

  1. хорошо комбинируются, дозируются;

  2. не вызывают вакцинно-ассоциированных заболеваний

  3. применяются у людей, страдающих иммунодефицитами

В Российской Федерации применяют убитые вакцины (против брюшного тифа, холеры, бешенства, гриппа, клещевого энцефалита, лентосиироза, коклюша.

Лечебные убитые вакцины против бруцеллеза, дизентерии, гонореи, стафилококковых инфекций. Лечебный эффект достигается за счет активации работы иммунной системы и факторов естественной резистентности организма. Лечебные убитые вакцины применяют при хронических, вялотекущих инфекциях; вводят в/мышечно, дозировано под контролем состояния больного.

К недостаткам корпускулярных вакцин (живых и убитых) следует отнести наличие в их составе большого количества «балластных» АГ и других компонентов, не участвующих в формиро­вании специфической защиты; они способны оказывать токсическое и/или аллергизируюшее влияние на организм.

3) Химические вакцины содержат отдельные компоненты (обладающие иммуногенностью) извлекаемые из микроорганизмов различными химическими методами Химические вакцины имеют следующие преимущества:

—менее реактогенны, пригодны для детей дошкольного возраста

Химические вакцины имеют ряд недостатков:

— иммуногенность химические вакцин ниже в сравнении с живыми, поэтому часто в такие препараты добавляют адъювант (гидрат окиси алюминия).

В Российской Федерации применяют вакцины для профилактики брюшного и сыпного тифов, менингококковую, гриппозную и др.

4) Анатоксины, анатоксины, получают путем обезвреживания формалином токсинов, являющихся продуктом метаболизма некоторых патогенных микроорганизмов. Они предназначены для иммунизации людей, используются в виде очищенных, концентрированных препаратов, адсорбированных на гидрате окиси алюминия. Для очистки их от балластных веществ нативные анатоксины подвергают специальной обработке различными химическими методами, в результате чего препараты не только освобождаются от балластных веществ, но и концентрируются по объему, что позволяет вводить необходимую дозу препарата в значительно меньшем объеме. Иммун­ная система человека не способна эффективно отвечать на одновременное введение нескольких антигенов. Адсорбция антигенов резко повышает эффективность вакцинации. Это объясняется тем, что в месте инъекции адсорбированного препарата создается «депо» антигенов, характеризу­ется замедленным их всасыванием; дробное поступление антигена из места инъекции обеспечива­ет эффект суммации антигенного раздражения и резко повышает иммунный эффект.

Анатоксины имеют следующие преимущества:

- препараты относительно термостабильны, однако
Анатоксины имеют ряд недостатков:

  • индуцируют только антитоксический иммунитет, что не позволяет предотвратить бактерионосительство и локализованные формы заболеваний

  • не допускается замораживание адсорбированных препаратов (АДС, АС, АД, АДС-м, и т.д.).

  • требуются повторные ревакцинации

Синтетические и полусинтетические вакцины, разрабатываемые в рамках проблемы повышения эффективности и снижения побочного действия вакцин, состоят из антигена или его де­терминанта в молекулярном виде, полимерного носителя (для придания макромолекулярности) и адъюванта, неспецифически повышающего иммуногенность АГ. В качестве носителя используют полиэлектролиты (винилпирролидон, декстран), с которыми соединяют АГ. Разрабатываются син­тетические вакцины против гриппа, гепатита В и др.

  1. векторные вакцины получают генно-инженерным способом. Получены сотни рекомбинантных штаммов бактерий, вирусов, дрожжей, несущих определенный антиген (например, сальмонеллезная вакцина против гепатита В)

  2. молекулярные вакцины получают путем биосинтеза (анатоксины) или химического синтеза (антигенные компоненты ВИЧ, гепатитов); молекулярные генноинженерные вакцины получают из протективных антигенов, которые нарабатывают рекомбинантные штаммы микроорганизмов (вакцина дрожжевая против гепатита В, против малярии и др.).

  3. Ассоциированные вакцины (поливакцины) включают антигены нескольких микробов и нередко в различных видах (убитые клетки, анатоксины и др.), что позволяет одновременно иммуни­зировать против нескольких инфекций.

В РФ используют одну ассоциированную вакцину АКДС (вакцина АКДС содержит убитые кок­люшные бактерии и 2 анатоксина - дифтерийный и столбнячный); за рубежом широко используют ас­социированные вакцины - тетракокк (коклюш, дифтерия, столбняк, полиомиелит); вакцина MMR (корь, эпидемический паротит, краснуха) и др.

Дифтерийный анатоксин (АД): содержит антиген в виде обезвреженного (0,4% р-ром формалина, при 370С, втечение 1 месяца) дифтерийного экзотоксина, соединенного с адъювантом; дозируется в мл, в 1 мл содержится 10 ЛФ (флоккулирующих единиц) дифтерийного анатоксина; используется для плановой специфической профилактики дифтерии путем парентерального (внутримышечно или глубоко подкожно) введения: действие основано на формировании искус­ственного активного антитоксического иммунитета к дифтерийному токсину.
1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   ...   15

перейти в каталог файлов


связь с админом