Главная страница
qrcode

Иммунофлюоресцентный анализ общие принципы


НазваниеИммунофлюоресцентный анализ общие принципы
Дата06.10.2019
Размер37.5 Kb.
Формат файлаdoc
Имя файлаИммунофлюоресцентный анализ.doc
ТипДокументы
#37757
Каталог

Иммунофлюоресцентный анализ: общие принципы

Иммунофлюоресцентный анализ, или реакция иммунофлюоресценции (РИФ),известен также как метод Кунса  основан на взаимодействии антигенов с антителами, но реагент при этом помечен красителем, светящимся в ультрафиолетовых лучах Иммунофлюоресцентный анализ применяют для выявления как антигенов, так и антител. Антитела чаще всего метят флюоресцеина изотиоцианатом. Меченые антитела связываются с антигеном, образуя комплексы, которые можно выявить с помощью флюоресцентной микроскопии.  Метод конъюгации глобулинов с органическими флюорохромами разработан в 1942 году А. Кунсом.
Суть явления люминисценции
Сущность явления люминесценции заключается в том, что при поглощении различных видов энергии (световой, электрической и др.) молекулами некоторых веществ их атомы переходят в возбужденное состояние, а затем, возвращаясь в исходное состояние, выделяют поглощенную энергию в виде светового излучения.

В РИФ люминесценция проявляется в виде флуоресценции — это свечение, возникающее в момент облучения возбуждающим светом и прекращающееся сразу после его окончания.

Многие вещества и живые микроорганизмы обладают собственной флуоресценцией (так называемой первичной), однако интенсивность ее очень мала. Вещества, обладающие интенсивной первичной флуоресценцией и используемые для придания флуоресцирующих свойств нефлуоресцирующим веществам, получили название флуорохромы. Такая наведенная флуоресценция называется вторичной.
Для возбуждения флуоресценции при люминесцентной микроскопии чаще всего используют ультрафиолетовую или сине-фиолетовую часть спектра (длина волны 300—460 нм). Для этих целей в лабораториях имеются люминесцентные микроскопы различных моделей.
Метод РИФ заключается в том, что антитела, соединенные с флуорохромом, сохраняют способность вступать в специфическую связь с гомологичным антигеном. Образующийся комплекс антиген + антитело в связи с присутствием в нем флуорохрома обнаруживают под люминесцентным микроскопом по характерному свечению.

Методика приготовления и окрашивания препаратов заключается в следующем:
-готовят на предметных стеклах мазки, отпечатки из органов или на покровных стеклах — инфицированную культуру клеток; можно использовать и гистосрезы;

-препараты подсушивают на воздухе и фиксируют в охлажденном ацетоне при комнатной температуре или при минус 15 °С (от 15 мин до 4—16 ч);

-окрашивают по прямому или непрямому методу;
-ведут учет под люминесцентным микроскопом по интенсивности свечения, оцениваемому в крестах.
Разновидности иммунофлюоресцентного анализа

Метод прямой иммунофлюоресценции применяют для выявления антигенов. Он основан на непосредственном связывании антигена, сорбированного на твердой подложке, с мечеными антителами. Реакцию оценивают с помощью флюоресцентного микроскопа.

Для оценки интенсивности специфической флюоресценции бактериальных клеток используется четырехплюсовая шкала: «+++» и «+++» – очень яркая и яркая; «++» и «+» – выраженная и слабая ободочная, зеленая флюоресценция клеток.


Анализ проводят для выявления антител к определенному антигену. Реагентом является немеченый антиген, который связывается с антителами, содержащимися в исследуемом материале. Затем добавляют реагент с мечеными антиантителами, т. е. антииммуноглобулинами. Иммунные комплексы взаимодействуют с ними и светятся при микроскопии.

:
На фиксированный препарат наносят немеченую сыворотку, содержащую антитела к предполагаемому вирусу, выдерживают 30 мин при 37 °С, отмывают несвязанные антитела. На препарат наносят флуоресцирующую антивидовую сыворотку, соответствующую виду животного — продуцента гомологичных противовирусных антител, выдерживают 30 мин при 37 °С. Затем препарат отмывают от несвязанных меченых антител, подсушивают на воздухе, наносят нефлуоресцирующее масло и исследуют под люминесцентным микроскопом.
Непрямой метод позволяет не только обнаружить и идентифицировать антиген, но и выявить и определить титр антител. Кроме того, этим методом можно обнаруживать одной меченой сывороткой антигены различных вирусов, так как он основан на использовании антивидовых сывороток.

Метод конкурентной иммунофлюоресценции основан на связывании стандартного меченого и присутствующего в исследуемой пробе немеченого антигенов с антителами, сорбированными на твердой подложке. Поскольку меченый и немеченый антигены конкурируют за связывание с антителами, по количеству связанного меченого антигена можно определить концентрацию антигена в исследуемой пробе.

Разработаны несколько модификаций непрямого метода. Наибольшего внимания заслуживает Достоинства и недостатки метода
-высокая специфичность и чувствительность;
-простота техники постановки;
-требуется минимальное количество компонентов.
-это экспресс-метод диагностики, так как в течение нескольких часов можно получить ответ.
К Однако благодаря имеющимся в настоящее время автоматизированным технологиям этот недостаток преодолим. Так исследование и оценка может выполняться вручную при помощи флюоресцентного микроскопа или автоматизировано с использованием проточного цитометра (flow cytometer) или микрочипового цитометра (сhip cytometer). Возможно применение конфокального микроскопа и роботизированного флюоресцентного микроскопа (в том числе совмещенных с проточным цитометром) в сочетании с программной системой обработки изображений.

перейти в каталог файлов


связь с админом