Главная страница
qrcode

Иммунитет Иммунитет


НазваниеИммунитет Иммунитет
Дата01.05.2020
Размер0.68 Mb.
Формат файлаpdf
Имя файлаИммунитет. Приготовление иммунных сывороток. Реакция агглютинаци
оригинальный pdf просмотр
ТипДокументы
#41219
Каталог
Тема
«ИММУНИТЕТ.
ПРИГОТОВЛЕНИЕ
ИММУННЫХ
СЫВОРОТОК.
РЕАКЦИЯ
АГГЛЮТИНАЦИИ В ДИАГНОСТИКЕ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ: ОПРЕДЕЛЕНИЕ
НЕИЗВЕСТНОГО МИКРОБА ПО ИЗВЕСТНОЙ СЫВОРОТКЕ И АНТИТЕЛ В ИССЛЕДУЕМОЙ
СЫВОРОТКЕ ПО ИЗВЕСТНОМУ ДИАГНОСТИКУМУ. РА НА СТЕКЛЕ И В ПРОБИРКАХ.
ПОСТАНОВКА И ПРИМЕНЕНИЕ РНГА. ФАГОЦИТОЗ».
Иммунитет
Иммунитетцелостная система биологических механизмов самозащиты организма, с помощьюкоторых он распознает и уничтожает все чужеродное
(генетически отличающееся).Центральным биологическим механизмом иммунитета является механизм распознавания «своего» и «чужого».
Выделяют двеосновные формы иммунитета: видовой (врожденный) и приобретенный.
В настоящее время считается, что наследственный (врожденный, видовой) и приобретенный иммунитет зависит от согласованной деятельности пяти основных систем: макрофагов, комплемента, интерферонов, Т- и В-лимфоцитов, главной системы гистосовместимости (МНС-I и
II класса), обеспечивающих различные формы иммунного ответа.Приобретенный иммунитет может быть естественный (результат встречи с возбудителем) и искусственный (иммунизация),
активный (вырабатываемый) и пассивный (получаемый), стерильный (без наличия возбудителя) и
нестерильный (существующий в присутствии возбудителя в организме), гуморальный и
клеточный, системный и местный, по направленности:антибактериальный, антивирусный,
антитоксический, противоопухолевый, антитрансплантационный.
Врожденный, или видовой, иммунитет – это выработанная в процессе филогенеза генетически закрепленная, передающаяся по наследству невосприимчивость данного вида и его индивидов к какому-либо антигену (или м/о), обусловленная биологическими особенностями самого организма, свойствами данного антигена, а также особенностями их взаимодействия.
Приобретенный иммунитет – это невосприимчивость к антигену чувствительного к нему организма человека, животных и пр., приобретаемая в процессе онтогенеза в результате естественной встречи с этим антигеном организма (вакцинация).
Факторы резистентности: неспецифическая и специфическая резистентность.
В основе видового иммунитета лежат различные механизмы естественной неспецифической резистентности. Среди них – кожные покровы и слизистые оболочки, нормальная микрофлора организма, фагоцитоз, воспаление, лихорадка, система комплемента, барьерные механизмы лимфоузлов, противомикробные вещества, выделительные системы организма, главная система гистосовместимости.
Специфические механизмы иммунитета— это антителообразование в лимфатических узлах, селезенке, печени и костном мозге.
Фагоцитоз
Механизм фагоцитоза состоит в поглощении, переваривании, инактивации инородных для организма веществ фагоцитами.
Клеточные факторы системы видовой резистентности – фагоциты, поглощающие и разрушающие патогенные микроорганизмы и другой генетически чужеродный материал.
Представлены полиморфоядерными лейкоцитами или гранулоцитами – нейтрофилами, эозинофилами и базофилами (клетками миелопоэтического ряда), а также моноцитами и тканевыми макрофагами (клетками макрофагально-моноцитарной системы).
Значение фагоцитирующих клеток для защиты организма впервые доказал И.И.Мечников, разработавший фагоцитарную теорию иммунитета.
Основные функции фагоцитов:

удаление отмирающих клеток и их структур (эритроциты, раковые клетки).

удаление неметабилизируемых неорганических веществ (частички угля, минеральная и др. пыль).

поглощение и инактивация микроорганизмов, их останков и продуктов.

синтез БАВ, необходимых для обеспечения резистентности организма (компоненты комплемента, лизоцим и др.).

участие в регуляции иммунной системы.

«ознакомление»
Т-хелперов с антигенами, т. е. участие в кооперации иммунокомпетентных клеток.
Стадии фагоцитоза
Процесс фагоцитоза (поглощения твердофазного объекта) состоит из пяти стадий.
1.Активация (усиление энергетического метаболизма)и хемотаксис(приближение фагоцита к объекту фагоцитоза). Факторами активации и хемотаксиса являются бактериальные продукты
(ЛПС, пептиды), компоненты комплемента (С3 и С5), цитокины и антитела.
2.Адгезия: связана с наличием ряда рецепторов на поверхности фагоцитов (к Fc-фрагментам антител, компонентам комплемента, фибронектину), обеспечивающих прочность рецепторопосредованных взаимодействий опсонинов, обволакивающих микроорганизмы и ограничивающих их подвижность (антитела, С3в, фибронектин).
3.Поглощение.Фагоциты обладают амебоподобными псевдоподиями. При поглощении образуется фагосома с поглощенным объектом (бактерией), к ней присоединяется и сливается содержащая литические ферменты лизосома, образуется фаголизосома.
4.Исход фагоцитоза.
Возможно три исхода фагоцитоза:
1) завершенный фагоцитоз – полное переваривание микроорганизмов в клетке- фагоците.
2) незавершенный фагоцитоз – выживание и даже размножение микроорганизмов в фагоците. Это характерно для факультативных и особенно - облигатных внутриклеточных
паразитов.
Механизмы персистирования в фагоцитах связаны:

с блокадой фагосомолизосомального слияния (вирус гриппа, микобактерии, токсоплазмы),

резистентностью к действию лизосомальных ферментов (гонококки, стафилококки),

способностью микробов быстро покидать фагосомы после поглощения и длительно пребывать в цитоплазме (риккетсии).
3) процессинг антигенов. К одной из важнейших функций макрофагов (наряду с хемотаксисом, фагоцитозом, секрецией биологически активных веществ) является переработка
(процессинг) антигена и представление его иммунокомпетентным клеткам с участием белков главной системы гистосовместимости (МНС) класса 2.
В процессе фагоцитоза происходит «окислительный взрыв» с образованием активных форм кислорода, что обеспечивает бактерицидный эффект.
Фагоцитоз – не только уничтожение чужеродного, но и представление антигена для запуска иммунных реакций и секреции медиаторов иммунных и воспалительных реакций. Система макрофагов – центральное звено не только естественной резистентности (видового иммунитета), но и играет важную роль в приобретенном иммунитете, кооперации клеток в иммунном ответе.
Антигены и антитела
Антигены – это биополимеры органической природы, генетически чужеродные для макроорганизма, при попадании в организм распознаются иммунной системой, вызывают
иммунные реакции, направленные на его устранение. Антигенами могут быть белки, полисахариды и нуклеиновые кислоты в комбинации между собой или липидами.
Антигены разделены на полные (иммуногенные), всегда проявляющие иммуногенные и антигенные свойства, и неполные (гаптены), не способные самостоятельно вызывать иммунный ответ. Гаптены могут стать иммуногенными при связывании с иммуногенным носителем
(например, белком), т.е. становятся полными.
За специфичность антигена отвечает гаптенная часть, за иммуногенность – носитель (чаще белок). Свойства антигенов: антигенность, специфичность, иммуногенность.
Антигены групп крови человека. Антигены групп крови человека определяются на мембране эритроцитов – «эритроцитарные антигены» системы АВО и Rh (резус-фактор).
Антигены гистосовместимости. На цитоплазматической мембране всех клеток организма находятся антигены гистосовместимости. Большая часть из них относится к системе главного комплекса гистосовместимости, или МНС. Антигены МНС осуществляют специфическое распознавание «свой-чужой» и индукцию приобретенного иммунного ответа.
СD-антигены. На мембране клеток имеются групповые антигены. СD-антигены используют для выявления отличий в группах клеток. Наиболее распространенные – маркеры иммунокомпетентных клеток: СDЗ, СD4, СD8, СD11а, СD11b, СD19-22.
Антигены бактерий. В структуре бактериальной клетки различают: соматические (ЛПС, термостабильный); жгутиковые (эпитопы сократительного белка флагеллина); капсульные антигены (кислые полисахариды (уроновые кислоты)).
Антигены вирусов. В структуре вируса различают группы антигенов: ядерные, капсидные, суперкапсидные.
Антитела – это γ-глобулины, вырабатываемые в ответ на введение антигена, способные специфически связываться с ним и участвовать в иммунологических реакциях.
Антитела синтезируются В-лимфоцитами – плазмоцитами. В соответствии с международной классификацией совокупность сывороточных белков, обладающих свойствами антител, называют иммуноглобулинами.
Различают 5 классов, или изотипов Ig: G, М, А, Е, D.
Уникальность антител заключается в том, что они способны специфически взаимодействовать только с тем антигеном, который вызвал их образование.
Иммуноглобулины ( Ig ) разделены в зависимости от локализации на три группы:
– сывороточные (в крови);
– секреторные (в секретах- содержимом желудочно-кишечного тракта, слезном секрете, слюне, особенно- в грудном молоке) обеспечивают местный иммунитет (иммунитет слизистых);
– поверхностные ( на поверхности иммунокомпетентных клеток, особенно В-лимфоцитов).
Свойства антител
Образование устойчивых иммунных комплексов: могут оказывать прямое или опосредованное воздействие на антигены: нейтрализовать, маркировать антигены, вызывать его деструкцию или элиминацию.
Основная схема иммунного ответа
1. Антиген, попадая в организм, в первую очередь сталкивается с естественными барьерами
– кожей, слизистыми оболочками и т.д. Многим микроорганизмам не удается преодолеть их.
2. Если вторжение все же произошло, антиген встречается с фагоцитирующими клетками.
3. Макрофаг (фагоцит) пожирает и переваривает антиген.
4. Если он не справляется с ним самостоятельно, то представляет на поверхности своей мембраны информацию о проникшем антигене. Это сигнал Т- или В-лимфоцитов.
5. В ответ на полученный сигнал о вторжении в периферических органах иммунной системы начинается отбор клеток, необходимых для борьбы именно с этим антигеном. Образуется клон соответствующих клеток. Одновременно формируется небольшое количество клеток памяти.
6. Реакция завершается при участии Т-клеток киллеров.
Иммунологический ответ по клеточному типу
Иммунный ответ на различные антигены может происходить по-разному. Если в борьбу вступают Т-клетки, это называется иммунный ответ по клеточному типу.
1. Антиген встречает первые препятствия – кожу и т.д.
2. Макрофаг поглощает антиген и представляет его на мембране.
3. Информация о противнике передается Т-хелперу.
4. Т-хелпер способствует формированию клона Т-киллеров. Образуются клетки памяти.
5. Т-киллеры способны разрушать вторгшиеся «чужие» клетки и клетки, зараженные вирусом.
6. Реакция завершается при участии Т-подавляющих клеток.
Иммунологический ответ по гуморальному типу с помощью Т- хелперов
При проникновении бактерий и некоторых вирусов может понадобиться гуморальный ответ.
Возможны два его варианта: с участием Т-хелперов и без их вмешательства.
1. Проникновение антигена.
2. Поглощение антигена и появление информации о нем на макрофаге.
3. Передача информации Т-хелперу.
4. Т-хелпер способствует активации В-клеток. Образуются клетки памяти.
5. В-клетки превращаются в плазматические клетки, способные к синтезу антител.
6. Плазматическая клетка вырабатывает именно те антитела, которые нужны для борьбы с поступившим антигеном. Они связывают его, образуя иммунный комплекс.
7. Комплекс антиген – антитело захватывается макрофагом и разрушается.
8. Завершение иммунологической реакции происходит при участии Т- подавляющих клеток.
Иммунологический ответ по гуморальному типу без помощи Т-клеток
1. Проникновение антигена.
2. Поглощение антигена и представление его на макрофаге.
3. Информация с макрофага передается на В-клетку.
4. В-клетки превращаются в плазматические клетки, вырабатывающие антитела.
5. Антитела связывают антигены.
6. Комплекс антиген – антитело удаляется макрофагом.
Первичный и вторичный иммунный ответ.
Первичный ответ – при первичном контакте с возбудителем (антигеном). Различают две фазы первичного иммунного ответа на антиген: индуктивная и продуктивная. Индуктивная – от момента введения антигена до появления антителообразующих клеток (12-20 ч); продуктивная – начинается к концу 1-х суток после введения антигена и характеризуется появлением антител в сыворотке крови. Количество антител постепенно увеличивается (к 4-му дню), достигая максимума на 7-10-й день, уменьшается к концу 1-го месяца.
Вторичный иммунный ответ развивается при повторном введении антигена. Индуктивная фаза намного короче – антитела вырабатываются быстрее и интенсивнее.
Основные отличия:
- продолжительность скрытого периода (больше при первичном);
- скорость нарастания антител (быстрее при вторичном);
- количество синтезируемых антител (больше при повторном контакте);
- последовательность синтеза антител различных классов (при первичном более длительно преобладают IgM, при вторичном – быстро синтезируются и преобладают IgG).
Вторичный иммунный ответ обусловлен формированием клеток иммунной памяти. Пример вторичного иммунного ответа – встреча с возбудителем после вакцинации.
Иммунологическая память
В основе иммунологической памяти лежит феномен вторичного иммунного ответа.
Иммунологическая память имеет высокую специфичность к конкретному антителу.
Существует 2 механизма формирования иммунологической памяти:
– длительное сохранение антигена в организме (персистирующие возбудители инфекций) поддерживает в напряжении иммунную систему;
– наличие клеток иммунологической памяти – малые покоящиеся клетки, дифференцирующие из Т- и В-лимфоцитов.
Положительные стороны иммунологической памяти: при вакцинации населения создается напряженный иммунитет, который поддерживается длительное время.
Отрицательные стороны иммунологической памяти: криз отторжения – повторная попытка трансплантировать уже однажды отторгнутую ткань вызывает быструю и бурную реакцию.
Иммунологическая толерантность
Иммунологическая толерантность – явление, противоположное иммунному ответу и иммунологической памяти. Проявляется отсутствием специфического продуктивного иммунного ответа организма на антиген из-за неспособности его распознавания. Иммунологическую толерантность вызывают антигены–толерогены. Характерна специфичность – она направлена к строго определенным антигенам.
Исторически иммунологическую толерантность рассматривают как защиту против аутоиммунных заболеваний. При нарушении толерантности к собственным антигенам могут развиваться аутоиммунные реакции или аутоиммунные заболевания, такие как ревматоидный артрит, системная красная волчанка и другие.
Практическая работа
Реакции взаимодействия антител с возбудителями и их антигенами (реакция «антиген- антитело») проявляется в виде ряда феноменов: агглютинации, преципитации, нейтрализации, лизиса, связывания комплемента, опсонизации, цитотоксичностии могут быть выявлены различными серологическими реакциями.
Оптимальное специфическое взаимодействие АТ с АГ происходит в изотоническом растворе с pH, близкой к нейтральному, при температуре +37°С.
Реакция агглютинации
Реакция агглютинации (agglutinacio – склеивание) – склеивание корпускулярных антигенов
(микроорганизмов, эритроцитов и др. клеток) под действием специфических антител в присутствии электролита, что проявляется образованием осадка (агглютината) в виде хлопьев или зерен.
Компоненты реакции
1) АГ – антиген (агглютиноген) в виде взвеси клеток (бактерий, эритроцитов, др.);
2) АТ – антитела (агглютинины) в виде иммунной сыворотки;
3) электролит (раствор NaCl).
Реакция агглютинации протекает в две фазы:
1) специфическая фаза – связывание детерминантной группы (эпитопа) АГ с АТ (невидимая фаза);
2) неспецифическая фаза (видимая) – образующийся комплекс (АГ+АТ) утрачивает растворимость и выпадает в осадок в виде хлопьев. Видимая реакция происходит в том случае, если антитела имеют два активных центра, к каждому из них присоединяется антиген, и в результате образуется «решетка».
Агглютинат образуется при соединении одного активного центра двухвалентного АТ с детерминантной группой одного АГ, а второго активного центра — с детерминантной группой другого АГ.
Иммунологические реакции используются с диагностической целью в двух направлениях для выявления:
1)
антигена микроорганизма (серологическая идентификация);
2)
антител в сыворотке крови пациента (серодиагностика).
Серологическая идентификация
Серотипирование (сероидентификация) – это идентификация неизвестного микробного АГ в выделенной (бактериологическим способом) чистой культуре микроорганизмов с помощью известной диагностической (агглютинирующей) сыворотки.
Диагностическая (агглютинирующая) сыворотка – иммунная сыворотка, содержащая АТ известной специфичности в известном титре.
Известные диагностические иммунные сыворотки получают путем гипериммунизации
(многократной иммунизации) животных (кроликов, лошадей) соответствующими АГ.
Иммунные сыворотки содержат АТ.
Различают следующие АТ: агглютинины, преципитины, бактериолизины, опсонины, антитоксины. Агглютинины вызывают склеивание микробов, дают реакцию агглютинации.
Преципитины обуславливают осаждение АГ – преципитацию. Бактериолизины вызывают растворение (лизис) бактерий – бактериолиз. Опсонины способствуют фагоцитозу. Антитоксины нейтрализуют действие микробного экзотоксина.
Разновидности реакции агглютинации:
– ориентировочная,
– развернутая,
– пассивной агглютинации (гемагглютинации).
Получение диагностических агглютинирующих сывороток
1. Иммунизация кролика.
Для получения агглютинирующих сывороток проводят многократную (5–7 раз) иммунизацию лабораторных животных, чаще кроликов, убитыми или живыми, но ослабленными микроорганизмами. Антигены (взвесь микробов) сначала вводят подкожно, а при последующих инъекциях – внутривенно в возрастающих дозах с интервалами в 3–5 дней. Через 7 дней после окончания иммунизации делают пробное кровопускание. Из крови готовится сыворотка, полученную сыворотку титруют.
Сыворотка разливается по ампулам и маркируется.
Титром агглютинирующей сыворотки является максимальное ее разведение, при котором наблюдается агглютинация (склеивание) гомологичных микробов.
Сыворотки могут быть:
- неадсорбированными, которые содержат групповые агглютинины и могут склеивать родственные в антигенном отношении бактерии,
- адсорбированные,которые не имеют групповых агглютининов и не вызывают групповой агглютинации:
- монорецепторными (моновалентными) или типоспецифическими
(содержат АТ одной специфичности, т. е. только к одному специфическому АГ возбудителя),
- поливалентными
(содержат АТ разной специфичности).
2. Титрование агглютинирующей сыворотки.
Исследуемый материал: сыворотка животного, гипериммунизированного бактериальной взвесью.
Диагностический препарат: взвесь убитых бактерий, применявшихся для гипериммунизации.
Принцип метода: к серийным разведениям агглютинирующей сыворотки добавляют равные количества взвеси убитых бактерий, применявшихся для получения этой сыворотки.
Положительный результат реакции: образование хлопьев, просветление жидкости.
Отрицательный результат: равномерная муть.
Кроме специфической агглютинации возможны спонтанная и «кислотная» неспецифические агглютинации. Чтобы их исключить всегда ставят контроль антигена (КА) с взвесью используемых в РА микробов в физ.растворе.
Определение титра агглютинирующей сыворотки
Разведение
сыворотки
Компоненты
реакции
1/100 1/200 1/400 1/800 1/1600 1/3200 1/6400 1/12800
КА
КС
физиологический раствор

1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
– агглютинирующая сыворотка в разведении 1/100 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

1,0 1,0 антиген
(взвесь микробов)
0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1

Результат реакции
Титр агглютинирующей сыворотки - наибольшее разведение сыворотки, в которой еще наблюдается агглютинация.
Постановка ориентировочной РА на стекле для определения неизвестного микроба
Ориентировочную реакцию агглютинации ставят на предметном стекле. Реакция служит для предварительного определения вида микроба.
Постановка реакции
1. На предметное стекло наносят каплю агглютинирующей сыворотки (опыт) и рядом - каплю физиологического раствора (контроль).
2. Исследуемую культуру микроба, взятую с поверхности плотной питательной среды, петлей вносят в каплю физиологического раствора и в каплю сыворотки и тщательно эмульгируют до получения гомогенной взвеси, затем стекло слегка покачивают.
3. Реакция происходит при комнатной температуре.
4. Результаты реакции учитывают невооруженным глазом через 2-4 мин.
Положительный результат - в капле с известной сывороткой наблюдается скучивание бактерий в виде хлопьев на фоне прозрачной жидкости, а контрольная капля физиологического раствора остается равномерно мутной.
Отрицательный результат - жидкость остается равномерно мутной, как и в контроле. Учесть результат через 2-3 минуты.
Постановка развернутой РА для определения неизвестного микроба
Реакция служит для определения вида микроба.
Постановка реакции
1) Из агглютинирующей сыворотки делают серию последовательных разведений (схема) путем переноса 1,0 мл из предыдущей пробирки в следующую пробирку (1,0+1,0 физ.раствора).
Из последней пробирки 1,0 мл разведенной сыворотки удаляют для сохранения одинакового объема.
Реакцию сопровождают контролем антигена (КА) и сыворотки (КС).
2) После того как сделаны разведения сыворотки, во все пробирки, кроме контроля сыворотки, вносят по 0,1 мл взвеси антигена. В пробирках при этом должна появиться небольшая равномерная муть. Контроль сыворотки остается прозрачным.
В контрольную пробирку (контроль антигена - КА) вносят 1 мл изотонического раствора хлорида натрия и 0,1 мл антигена.
3) Пробирки тщательно встряхивают и помещают в термостат (37°С). Предварительный учет результатов реакции производят через 2 ч, а окончательный - спустя 18-20 ч (выдерживая при комнатной температуре).
4) Учет реакции развернутой агглютинации производят, оценивая последовательно каждую пробирку, начиная с контрольных, при осторожном встряхивании.
Определение неизвестного микроба по известной сыворотке
Разведение
сыворотки
Компоненты
реакции
1/100
1/200
1/400
1/800
1/1600
1/3200
КА
КС
физиологический раствор

1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
– агглютинирующая сыворотка
1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

1,0 1,0 антиген
(взвесь микробов)
0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1

Результат реакции
В контрольных пробирках агглютинации не должно быть.
Контроль сыворотки(КС) всегда остается прозрачным.
В контроле антигена (КА)всегда наблюдается равномерное помутнение.
Реакцию считают положительной, если агглютинация отмечается в разведениях, близких к титру агглютинирующей сыворотки.
Серодиагностика
Серодиагностика — это определение неизвестных АТ в сыворотке крови больного с помощью известного антигенного диагностикума.
Диагностикум — взвесь убитых нагреванием или химическими веществами бактерий или извлеченных из них АГ.
Виды диагностикумов: О-, Н-, Vi-диагностикумы, эритроцитарный антигенный диагностикум и др.
Антитела к возбудителю заболевания у пациента появляются, как правило, к концу 1-й недели заболевания, с этого времени и используют серодиагностику.
Серодиагностику могут проводить как для выявления наличия АТ (качественные реакции), так и для определения количества АТ (нарастание титра — метод «парных сывороток»).

При постановке иммунологических реакций для серодиагностики определяют титр АТ в сыворотке крови пациента (титр сыворотки).
За титр сыворотки принимают максимальное (последнее) разведение сыворотки крови пациента, в которой еще наблюдается положительный результат реакции.
Выделяют следующие критерии серодиагностики: диагностический титр и нарастание титра
АТ.
Диагностический титр — это титр АТ, указывающий на заболевание, т.е. в данном титре реакция положительна только у больных и отрицательна у здоровых.
Если полученный титр сыворотки крови пациента выше, чем диагностический титр, пациенту ставят серологический диагноз соответствующего заболевания.
Если полученный титр сыворотки ниже диагностического титра, то на данном временном этапе серологически диагноз заболевания не подтверждается.
Нарастание титра АТ
Достоверные результаты получают при исследовании парных сыворотоккрови больного: одной — взятой к концу 1-й недели заболевания, и второй — через 7-14 дней, когда титр антител повышается под воздействием находящегося в его организме патогенного микроорганизма. В этом случае удается наблюдать динамику нарастания титра АТ.
Постановка развернутой РА для определения антител в сыворотке больного
Применение РА для серологической диагностики брюшного тифа, паратифов (реакция
Видаля), сыпного тифа (реакция Вейгля), бруцеллеза (реакция Райта), туляремии и других инфекционных заболеваний – основано на определении АТ (агглютининов) в сыворотке больных.
Постановка реакции
1) Кровь больного в количестве 3-4 мл берут натощак, отделяют сыворотку.
2) Сначала готовят в физ.растворе основное разведение сыворотки, из которого делают серию последовательных разведений (схема) путем переноса 1,0 мл из предыдущей пробирки в следующую пробирку (1,0+1,0 физ.раствора).
Из последней пробирки 1,0 мл разведенной сыворотки удаляют для сохранения одинакового объема.
Реакцию сопровождают контролем антигена (КА) и сыворотки (КС).
3) После того как сделаны разведения сыворотки, во все пробирки, кроме контроля сыворотки, вносят по 0,1 мл диагностикума (известный антиген) В пробирках при этом должна появиться небольшая равномерная муть. Контроль сыворотки остается прозрачным.
В контрольную пробирку (контроль антигена - КА) вносят 1 мл изотонического раствора хлорида натрия и 0,1 мл диагностикума.
4) Пробирки тщательно встряхивают и помещают в термостат (37°С). Предварительный учет результатов реакции производят через 2 ч, а окончательный - спустя 18-20 ч (выдерживая при комнатной температуре).
5) Определяют титр сыворотки больного, оценивая последовательно каждую пробирку, начиная с контрольных, при осторожном встряхивании.
6) Далее полученный титр реакции сравнивают с диагностическим.
В контрольных пробирках агглютинации не должно быть.
Контроль сыворотки (КС) всегда остается прозрачным.
В контроле антигена (КА) всегда наблюдается равномерное помутнение.
Положительный результат - полученный титр сыворотки крови пациента выше, чем
диагностический титр.
Отрицательный результат - полученный титр сыворотки ниже диагностического титра.
Определение антител в сыворотке больного
Разведение
сыворотки
Компоненты
реакции
1/100
1/200
1/400
1/800
КА
КС
физиологический раствор

1,0 1,0 1,0 1,0
– сыворотка больного в разведении
1/100 1,0 1,0 1,0 1,0

1,0 1,0 диагностикум
0,1 0,1 0,1 0,1 0,1

Результат реакции
Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА, РПГА)
Антитела сыворотки крови пациента для серодиагностики выявляют с помощью РПГА -
реакции, в которой АТ взаимодействуют с высокодисперсными АГ (гаптенами), предварительно адсорбированнымина эритроцитах (эритроцитарный антигенный диагностикум), которые при этом склеиваются.
Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) отличается значительно более высокой чувствительностью и специфичностью, чем реакция агглютинации. Ее используют для идентификации возбудителя по его антигенной структуре или для индикации и идентификации бактериальных продуктов — токсинов в исследуемом патологическом материале.
Для приготовления эритроцитарного диагностикума чаще всего используют эритроциты барана, обладающие высокой адсорбирующей активностью.
Антигенами могут служить полисахаридные АГ микроорганизмов, экстракты бактериальных вакцин, АГ вирусов и риккетсий, а также другие вещества.
Адсорбционная емкость эритроцитов увеличивается при обработке их растворами танина или хлорида хрома.
Постановка реакции
1) В лунках пластмассовых пластин готовят последовательные разведения сыворотки больного в объеме 0,5 мл.
2) В каждую лунку вносят одинаковый объем (0,25 мл) 3% суспензии эритроцитарного диагностикума.
3) Помещают в термостат (37°С). Учет результатов реакции производят через 2 ч.
5) Определяют титр сыворотки больного, оценивая последовательно каждую пробирку, начиная с контрольных, при осторожном встряхивании.
6) Далее полученный титр реакции сравнивают с диагностическим.
Результат реакции:
При положительной реакции, в результате образования комплекса (АГ-АТ) на поверхности эритроцитов, последние склеиваются и равномерно покрывают все дно пробирки или всю лунку пластинки в виде зонтика с неровными краями.
При отрицательной реакции эритроциты выпадают в плотный осадок в виде диска с ровными краями («пуговки»).
Титром сыворотки в исследуемом материале считают последнее максимальное разведение, которое еще вызывает агглютинацию эритроцитов.
1/10
1/20
1/40
1/80
1/160
1/320
1/640
КА
+
+
+
+
+



перейти в каталог файлов


связь с админом