Главная страница
qrcode

Эмбриональные стволовые клетки


Скачать 13.34 Mb.
НазваниеЭмбриональные стволовые клетки
АнкорЭмбриональные стволовые клетки. В.С. Репин.doc
Дата22.09.2017
Размер13.34 Mb.
Формат файлаdoc
Имя файлаЭмбриональные стволовые клетки. В.С. Репин.doc
ТипДокументы
#23322
страница9 из 13
Каталогid326642450

С этим файлом связано 46 файл(ов). Среди них: angionevrologia.pdf, Занятие 10.doc, eduard-m-w-weber-schemata-der-leitungsbahnen-des-menschen.pdf, Занятие 9.doc, Lektsii_po_anatomii.pdf, Занятие 8.doc, skhema_analiza_i_protokol.pdf, Занятие 7.doc, Rentgenopulmonologija.pdf, Занятие 6.doc и ещё 36 файл(а).
Показать все связанные файлы
1   ...   5   6   7   8   9   10   11   12   13
ГЛАВА ВТОРАЯ

Стволовые клетки в эмбриогенезе мозга млекопитающих
"Природа работает в любых масштабах, если она этого пожелает"

К. Бонне (1764 г )

1. Модели на стыке клеточной биологии и геномики
Истоки всех сил развития ЦНС изначально концентрируются в монослое нейроэктодермы зародыша. Начальный морфогенез мозга представляет диалог "soft-сигналов" с провизорными клетками нервной трубки, включающий скрытый латентный период преобразования soft-signals в новые молекулярные устройства и новый фенотип клеток. Программы меняют устройство клеток через набор транскрипционных факторов. Устройство клеток определяет их судьбу и функции. Эмбриогенез ЦНС – это многократный рост численности с одновременным кардинальным обновлением клеток. Одиночные стволовые клетки превращались в сеть прогениторных клеток, которые в ходе миграции дифференцировались в специализированные линии нейронов и глии. В ходе гаструляции монослой примитивной нейроэктодермы (эпибласта) превращается в три зародышевых листка: экто-, мезо- и эндодерму. Значительная часть первичной эктодермы трансформируется в нейроэктодерму - провизорный орган и временный банк основной массы некоммитированных стволовых клеток. Три зародышевых слоя генерируют плюрипотентные стволовые клетки. Образование эктодермы и мезодермы происходит in vitro из тотипотентных клеток тератокарциномы или ЭСК. Удаление из среды культивирования LIF и слоя фидера вело к остановке пролиферации. Постмитотические незрелые клетки дифференцировались в эмбриоидные тельца. Варьируя комбинацией ростовых факторов/индукторов, направляли дифференцировку агрегатов ЭСК в сторону эктодермы или мезодермы. Хотя НСК удавалось получить из ЭСК в культуре, этот путь , как мы увидим , методически труден и пока работает лишь в микромасштабе. Вырастить нейросферы из клеток первичной нейроэктодермы пока также не удалось. В то же время культуру НСК получили практически без проблем из всех отделов развивающегося мозга. Интересен механизм роста клонов НСК. Прогениторные клетки, покидающие клон, подвергались рестрикционному созреванию. Часть клеток вне клона направленно мигрировала в развивающемся мозге. Незаменимую роль в миграции прогениторных клеток играла сеть радиальной глии (РГ), которая опережающе возникала из нейромезенхимы, а также стволовых клеток хориоидного сплетения. Большинство дефинитивных структур мозга млекопитающих и человека собрано из пришлых клеток.

Быстрый прогресс в методах выращивания ЭСК и НСК был обусловлен несколькими обстоятельствами. Во-первых, метод двойной рекомбинантной делеции (нокаута) материнской и отцовской аллели гена в ЭСК приоткрыл роль многих «ранних» генов органогенеза и нейруляции. С помощью knockout-мутаций составлена карта расположения главных генов на хромосомах, реестр их функций, место и время действия в нервной трубке, прозо- и ромбомерах. Во-вторых, пересадки стабильно меченых НСК/прогениторных клеток в мозг развивающихся зародышей дали метод количественного подсчета founder cells в коре, мозжечке, гиппокампе. С помощью меченых НСК составлена карта "миграции" клонов в растущем развивающемся мозге. В-третьих, культура эксплантатов помогла расшифровке эпигеномных механизмов нейрогенеза (индукция нервной пластинки, регионализация нервной трубки, селекция клеток апоптозом, направленная миграция прогениторных популяций, терминальная дифференцировка постмитотических клеток ).

Стволовые клетки начинают все программы поэтапного развития мозга как у млекпитающих, так и у человека. Software созревания нейрональных стволовых клеток in situ и in vitro остается ключем к практическим целям, имея в виду направленную регенерацию поврежденного спинного и головного мозга.

НСК мозга млекопитающих и человека характеризуются следующими особенностями: 1) возникают естественным путем в нервной трубке 2) имеют "минимальный" белковый фенотип 3) делятся ассимметрично, либо симметрично в клонах 4) сохраняют потенцию к максимальному числу делений в незрелом состоянии

5) сохраняют плюрипотентность - способность дифференцироваться в любую специализированную линию нейронов, олигодендроцитов или астроглии 6) сохраняют мультипотентность в реципиентной ткани 7) сохраняют фенотипическую гетерогенность в разных отделах мозгах (в том числе к сигналам пролиферации и дифференцировки) 7) хорошо выживают в изолированной мозговой ткани при +4 С 8) Имеют ограниченный набор "маркерных" молекул для идентификации. Белковый репертуар и антигенный "профиль" НСК много беднее, чем нейронов и глии.

2. Нервная трубка - первоисточник провизорных стволовых клеток
Подобно другим провизорным органам, нервная трубка является временным вместилищем стволовых клеток ЦНС. Нервная система зародыша человека возникает из трех областей нейроэктодермы: 1) нервной пластинки (ЦНС, соматические мотонейроны и преганглионарная часть вегетативной нервной системы) 2) клеток нервного гребня ( периферическая автономная нервная система) 3) эктодермальной плакоды (сенсорные ганглии краниальных нервов, гипофиз, нейроэпителий внутреннего уха и глаза). Процесс закладки и формирования нервной трубки протекает в несколько стадий. Сперва по краям нервной пластинки появляются мигрирующие нервные складки, которые, сливаясь по срединной линии, дают нервную трубку. Белковый продукт гомеозисного Sox-1 гена выявлялся в первичной нейроэктодерме, хотя мРНК всего семейства HMG-(high mobility group) Х-хромосомы гораздо раньше накапливались в зрелых яйцеклетках и сохранялись в ранних зародышах. Белки-репрессоры Sox-генов контролируют плотную упаковку хроматина с удержанием плюрипотентности генома клеток нейроэктодермы (Vriz S., Joly C., Boulekbache H. et al., 1999 ). Sox-1, Sox-2, Sox-3 гены уже экспрессированы в нейроэктодерме на стадиях образования первых сомитов Второй парой генов, контролирующих плюрипотентность генома нейроэктодермы, являются Xdbx и Xash3. Избыточная экспрессия этой пары генов в нервной трубке вызывала остановку созревания и избыточную пролиферацию незрелых клеток. Продукты последних двух генов блокировали эктопический нейрогенез НСК после пересадки кусочков нейроэктодермы в мозг реципиентов (Gershon A.A., Ridnick J., Kalam L. et al., 2000). Семейство Zic- генов также экспрессировано в начале нейрогенеза. В дорзальной части нервной трубки экспрессированы мРНК Zic-1 гена. После закрытия нервной трубки Zic-1 ген экспрессирован в клетках нервного гребня, включая мигрирующие прогениторные популяции, покидающие гребень.

Рис 2-1. Схема направленной миграции прогениторных клеток мозга эмбрионов по матриксу радиальной глии
Рецепторы клеточной адгезии играли решающую роль в направленной миграции клеток нервной трубки. Передняя часть нервной трубки трансформировалась в головной мозг. Нервная трубка над нотохордой превращалась в спинной мозг. Первый прорыв был связан с расшифровкой механизма действия организатора, описанного в 20-х годах ХХ века Шпеманном и Мангольдом. Трансплантация нотохорды перепела в эмбрион цыпленка вызывала образование дополнительной нервной трубки. Это подтвердило эквипотенциальность организатора у разных видов. Эктопический гомотрансплантат клеток с сильно экспрессированным геном goosecoid индуцировал образование второй оси развития зародыша, причем донорские клетки "навязывали" зародышу-реципиенту экстра- нейруляцию. Опыты доказали ключевую роль гена goosecoid в запуске нейруляции (Boncinelli E., Mallamaci A., 1995). На следующем этапе транскриптаза goosecoid запускала второй эшелон регуляторов. Секретируемые окружающей тканью белки noggin, chordin, follistatin, Xnr3 инактивировали действие ВМР-7/ВМР-4, блокируя превращение плюрипотентной незрелой эктодермы в мезодерму. Стимуляторы нейруляции ( FGF -2, FGF-5, Wnt1, Wnt3, Sonic Hedgehog - SHH-A) направляли созревание плюрипотентных клеток в линии нейронов/глии. Мутация SHH-/- блокировала сегментацию и образование прозомеров в передней части нервной трубки мышей. Избыточная экспрессия транскриптазы Wnt-1 вела к региональной экспансии незрелых клеточных масс.

Баланс концентрации противоположных по эффекту сигналов направлял созревание нейроэпителия. Главным "вентральным" сигналом был белок SHH, секретируемый нотохордой. (Рис 2-2). Зародыши Mash-1 -/- мышей погибали из-за тотального блока развития нервной трубки, нарушения созревания гранулярных клеток мозжечка, рецепторных клеток внутреннего уха, краниальных сенсорных нейронов, обонятельных нейронов, адренэргических нейронов базальных структур мозга и периферической нервной системы. У Math1-/- мышей было блокировано развитие гранулярных нейронов мозжечка и рецепторных нейронов внутреннего уха. Этот же ген, видимо, выключал созревание гранулярных клеток мозжечка и рецепторных клеток вестибулярного аппарата и внутреннего уха (Helms A.W., Abney A.L., Ben-Arie N. et al., 2000).


Стимуляторы пролиферации

SHH

Chordin

Noggin

Follistetin

Xnr3

FGF-2

FGF-5

Wnt-1

Wnt-3



Блокаторы пролиферации
BMP4 BMP7

дорзалин

TGF-

Абортивный ранний нейрогенез



Рис 2-2. Схема экспрессии генов нейруляции

На больших растояниях эффект SHH уравновешивался Gli3- транскриптазой. С дорзальной стороны эпидермис генерировал три сигнала - ВМР-4, ВМР-7 и дорзалин (дериват TGF-beta). Латеральная экспрессия Рах-3 и Рах-6 в мезодерме необходима для нормального развития нервной трубки. Рах-3/Рах-6 метят прогениторные пролиферирующие клетки. Замыкание нервной трубки завершало образование монослоя нейроэпителия - эпендимы. У зародышей мышей Lim1-/- блокировано закрытие нервной трубки. Noggin, chordin, follistatin служили костимуляторами формирования нервной трубки. SHH множественными путями участвовал в нейруляции с разными группами плюрипотентных клеток. В ранних провизорных и стволовых клетках была выявлена изоформа SHH-A, которая напрямую связана с митотическим каскадом МАРК и с рецептором тирозиновой киназы RPTK ( Conti L., Sipione S., Magrassi L. et al , 2001). В новорожденном мозге SHC-A локализован исключительно в герментативном слое ЦНС. В постмитотических нейронах идентифицирована другая изоформа –SHC-C. Активаторы цАМФ и протеинкиназы С также стимулировали образование нервной трубки. Первичная нейруляция сопровождалась образованием нервного гребня из клеток нейромезенхимы .

В эпендиме/субэпендиме концентрировались главные пулы стволовых клеток нервной трубки, что верифицировано прокраской срезов развивающегося мозга мышей и крыс антителами к нестину. Количество нестин+ клеток (дериватов нейроэпителия трубки) экспоненциально нарастало по всем областям растущего мозга. Антитела к нестину окрашивали новообразованные клетки радиальной глии (РГ). Рост нестин+ клеточной массы визуально прослеживали на макросрезах головного мозга у трансгенных животных .


Рис 2-3. Визуализация нестин+ стволовых/прогениторных клеток в головном и спинном мозге зародыша мыши 16 дня развития

У трансгенных зародышей c вставленной конструкцией флуоресцентного GFP-белка под нестиновым промотером подавляющая часть светящихся клеток собрана вокруг перивентрикулярной области мозга. Слои GFP-окрашенных клеток радиально разрастались in situ, заполняя все быстро растущие области головного мозга. Зоны интенсивного роста состояли из клонов НСК, клетки которых делились и направленно мигрировали в новые отделы и ядра мозга. ( Рис. 2-3). На поздних стадиях созревания нейробластов градиент SHH достаточен для вентральной дифференцировки мотонейронов. С дорзальной стороны ВМР-4, ВМР-7 и дорзалин направляли дифференцировку сенсорных нейронов. В постнатальном периоде НСК сохранялись в эпендиме и субэпендимальном слое вокруг желудочков, а также в гиппокампе, обонятельной луковице, коре и других структурах (Dalstrand J., Lardelli M., Lendahl U.,1995).

Перивентрикулярная область взрослого мозга млекопитающих остается "реликтом" эмбрионального мозга с остатками стволовых ниш. В этих зонах сохранились гетерогенные популяции плюрипотентных клеток (Doetsch, F., Caille, I., Lim, D.A., et al., 1999). Эти клетки in situ прокрашивались антителами к нестину, виментину, GFAP и Noggin. Локальные инъекции Noggin стимулировали разрастание перивентрикулярных клонов прогениторных клеток в мозге взрослых животных (Lim D.A., Tramontin A.D.,Trevejo J.M. et al., 2000). Локальные инъекции bFGF, EGF стимулировали не только пролиферацию реципиентных, но и донорских НСК, трансплантированных в фетальный и постнатальный мозг млекопитающих (Abe K., Saito H., 2001; Fricker-Gates R.A., Winkler C., Kirik D. et al.,2000) Один из главных эффектов Noggin связан с нейтрализацией ВМР-4. В мозге взрослых животных локальные концентрации эндогенных стимуляторов пролиферации, по-видимому, уравновешивались высокой концентрацией ВМР-4 и ВМР-7. Эти условия тормозили обновление нервных клеток в перивентрикулярной области мозга взрослых. Практически в каждом послеоперационном образце субвентрикулярной ткани взрослых людей выявляли мелкие и крупные нейросферы, окруженные плотным матриксом и слоем астроглии, которая окрашивалась антителами на GFAP. Авторы предположили, что глия вокруг нейросфер играет роль фидера, формирующего стволовую нишу (Kukekov V.G., Laywell E.D., Suslov O. et al, 1999).

Вторым источником стволовых клеток является эпендима хориоидных плексусов. Ранее предполагали, что региональные сосудистые сплетения выполняет лишь трофическую функцию, секретируя в ликвор все необходимык ростовые и поддерживающие факторы. Питание стволовых перивентрикулярных пространств осуществляется через ликвор со стороны эпендимы (Leventhal C., Rafii S., Rafii D., et al, 1999). Сосудистые сплетения эмбрионального мозга имеют множественные зоны пролиферирующего эпителия, напоминающие по фенотипу стволовые клетки ( Коржевский Д.Е., 1999). У зародышей хориоидное сплетение играет роль поставщика нейральных стволовых клеток. Если нейроэпителий сплетения возникает из нервной трубки, то сосудистая мезенхима играет роль фидера, сохраняющего плюрипотентность НСК ( Kitada M., Chakrabortty S., Matsumoto N. et al.,2001). Эпендимальные клетки сосудистых сплетений были изолированы в культуру от так называемой «зеленой» трансгенной мыши, в которой ген флуоресцентного белка был поставлен под актиновый промотор. Практически это означало, что в культуре или после трансплантации клетки эпендимы светились флуоресцентной меткой. Исходные клетки эпендимы не прокрашивались антителами к виментину, нестину, GFAP, GLT-1, beta-tubulin III, MBP. После пересадки этих клеток в зону повреждения спинного мозга появлялись GFAP+, vimentin+ клетки, которые через 2-3 недели дифференцировались в типичные астроциты, но не нейроны. Часть НСК покидала сплетение и мигрировала в мозг ( Catala M., 1998). Однако выделить НСК в виде клонов in vitro из ткани хориоидных сплетений пока не удалось ( Gabrion J.B., Herbute S., Bouille C. et al., 1998)

Третьим источником НСК является «реликты» нейроэпителия, сохраняющегося в спинном мозге. Такие ранние нейроэпителиальные клетки при плотности 100-300 клеток/мл росли суспензионными клонами (нейросферами) на бактериальных чашках ( клоногенность = 1-2,5%) ( Kalyani A., Hobson K., Rao M.S., 1997). Клетки дезагрегированных нейросфер прикреплялись к дну чашек , покрытых ламинином, и дифференцировались в нейроны, глию и олигодендроциты. Нейросферы пассировали в селективной среде с bFGF и EGF. В отличие от НСК мозга ранние нейроэпителиальные клетки спинного мозга культивировали и размножали в прикрепленном недифференцированном состоянии в минимальных плотностях в среде с bFGF + экстракт зародыша цыпленка. Часть прикрепленных клеток окрашивалась антителами к нестину, 1-5 % клеток окрашивались антителами к GFAP. Часть клеток принадлежала к стволовым/прогениторным клеткам нервного гребня. Из этих предшественников дифференцировались шванновские клетки и периферические нейроны при добавлении цАМФ, сыворотки в среде, содержащей EGF,bFGF, NGF ( Kalyani A., Hobson K., Rao M.S., 1997). Пока не ясно, как обнаруженные особенности профиля НСК в спинном мозге связаны с особенностями эмбриогенеза. Нервная трубка спинного мозга детерминирована генерировать только сенсорные и моторные нейроны. На примере прогениторных клеток спинного мозга разработана иерархическая схема дерепрессии генов эмбриогенезов по сегментам спинного мозга. В исходных незрелых прогениторных клетках функционируют 5 комплексов репрессии генома. Последовательная дерепрессия открывает лишь один из 5 возможных способов активации хроматина. К примеру, SHH- зависимая активация гена Рах-6 открывает путь к дерепрессии только одного из 5 репрессоров второго эщелона –Nkx2.2/2.9. Первичная дерепрессия гена Irx вызывает селективную вторичную дерепрессию лишь Olig2. Селективная дерепрессия Dlbx2 вызывает комплементарную дерепрессию NKX6.1, а Dlbx1 активирует Nkx6.2. Такая сегментарно собранная сеть транскрипционных факторов позволяет в полуавтоматическом режиме обеспечивать сборку нервных сетей, собранных из мото – и сенсорных нейронов разного фенотипа. Исходно вся сеть собрана из общих ранних предшественников ( Lee S.K., Pfaff S.L.,2001).

3. Стволовое пространство обонятельного нейроэпителия
Эпендима как орган регенерации мозга привлекла к себе внимание после исследований эмбриогенеза и регенерации спинного мозга рыб. У многих видов рыб выявлена высокая скорость обновляемости нервных клеток даже в зрелом периоде. В эпендиме постоянно образовывались новые клоны НСК, из которых клетки мигрировали в зоны повреждения головного и спинного мозга. Мозг певчих птиц оказался второй удачной моделью для изучения обновления стволовых пространств эпендимы. Мозг канареек, снегирей выделялся высокой скоростью обновления клеток ( около 1.5% клеток подвергались смене каждые 24 часа у взрослых особей). Как правило, миграторные незрелые клетки теряли N- кадхерин. Исследования были облегчены открытием в прогениторных нейронах птиц РНК-связывающего белка Hu, который исчезал в зрелых постмитотических нейронах С помощью антител к Hu- белку было показано, что первое поколение дочерних стволовых клеток оставались в субэпендиме до 4-5 дней перед началом миграции. Этим регенерация взрослой мозговой ткани отличалась от нейрогенеза эмбрионов, у которых дочерние стволовые клетки немедленно покидали субэпендиму. Возможно, что лаг-фаза необходима для потери N-кадхерина. Антитела к нейрональному NCAM блокировали адгезию прогениторных клеток. Однако большинство новообразованных клеток располагались между субэпендимой желудочков и центром пения (дорзомедиальный неостриатум). НСК после деления оставались в субэпендиме, тогда как дочерние клетки экспрессировали рецепторы навигации и устремлялись в паренхиму высших отделов головного мозга. Прогенторные клетки мигрировали по специальным каналам, которые были выстланы слоем вытянутых глиальных клеток. Последние инкрустировали каналы миграции специальными белками, которые направляли миграцию незрелых клеток.

Обонятельный эпителий имел как правило трехслойную архитектуру. Апикальный слой состоял из зрелых специализированных нейроэпителиальных клеток. Каждый зрелый нейрон имел лишь один тип обонятельного рецептора (ОР), экспрессированного на внешней поверхности плазматической мембраны сильно поляризованных клеток. Зрелый эпителий насчитывал до 1000 типов клеток, несущих разный рецептор. Зрелые нейроны определяли не только по положению , но маркерным рецепторам, включая белок ОМР. Созревающие нейроны промежуточного фенотипа располагались ниже несколькими слоями. Еще ниже располагались пролиферирующие прогениторные слои клеток.

Сами стволовые клетки (НСК) покоятся на базальном слое эпителиальных клеток, распластанных монослоем вдоль базальной мембраны. В некоторых ямках сосредоточены скопления (колонии) НСК округлой формы. Клетки вокруг ямки экспрессировали мРНК для FGF-8. В отличие от более вытянутых пргениторных клеток, стволовые клетки не экспрессировали мРНК гена Mash-1. Однако клетки маркировались антителами к нестину. НСК также маркировались антителами к рецептору для EGF.

У мышей весь путь от переднего рога богового желудочка до обонятельной луковицы был представлен слоями мигрирующих незрелых нейронов между слоями астроглии. Плотность нейронов примерно в 4 раза превышала плотность глии. Прогениторные клетки мозжечка зародышей 11-12-й нед развития лишены “навигационной информации” . N- кадхерин-минус прогениторные клетки теряли способность к направленной миграции.

1   ...   5   6   7   8   9   10   11   12   13

перейти в каталог файлов


связь с админом