Главная страница
qrcode

Аффинная хроматография


НазваниеАффинная хроматография
Дата29.06.2020
Размер1.38 Mb.
Формат файлаdocx
Имя файлаАффинная хроматография (1).docx
ТипАнализ
#42488
Каталог

МИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ

РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

МОСКОВСКИЙ ПОЛИТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

«Аффинная хроматография»

Выполнили студенты группы 181-541:

Овчинникова Анастасия

Страхова Софья

Проверил преподаватель:

Козюхин С.А.

Москва 2020
Цель: изучить аффинную хроматографию, как способ аналитического анализа.
План:
Определение понятия “аффинная хроматография”;
  • Неподвижная фаза в аффинной хроматографии;
  • Подвижная фаза в аффинной хроматографии;
  • Анализируемые вещества в аффинной хроматографии;
  • Принцип действия аффинной хроматографии, с какими точностью и чувствительностью возможно определять состав смеси;
  • Необходимое оборудование для аффинной хроматографии;
  • Примеры использования аффинной хроматографии.

    1. Определение понятия “аффинная хроматография”
    АФФИННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ – метод очистки и разделения белков, основанный на их избирательном взаимодействии с лигандом, ковалентно связанным с инертным носителем. В качестве лигандов используют соединения, взаимодействия которых с разделяемыми веществами основано на биологической функции последних. Так, при разделении ферментов (для чего преимущественно и применяется аффинная хроматография) лигандами служат их субстраты, ингибиторы или коферменты.

    Главная особенность, которая обусловливает высокую эффективность аффинной хроматографии, состоит в том, что разделение основано на различии не физико-химических признаков молекулы (заряда, формы и размера), а специфичных функциональных свойств, отличающих данный фермент от множества других биополимеров.
    2. Неподвижная фаза в аффинной хроматографии
    Неподвижная фаза в аффинной хроматографии представляет собой специально получаемый сорбент, построенный обычно по схеме: носитель - соединяющее звено ("ножка") - специфический лиганд. Носителем служит чаще всего сефароза-производное агарозы, имеющее поперечные сшивки. Присоединение к ней лиганда или "ножки", содержащих, как правило, аминогруппу, осуществляется после активации сефарозы бромцианом:

    Содержание лиганда колеблется от 0,1 до 10 мкмоль на 1 г влажного сорбента. Сефароза, однако, малоустойчива к действию ряда химических веществ и микроорганизмов.

    Более стабильны макропористые неорганические носители (кремнезем, стекло) и органические полимеры. Если лиганд присоединяется непосредственно к носителю, эффективность специфичного взаимодействия с ферментом заметно снижается вследствие пространственных затруднений. Для их устранения при контакте лиганда применяют дополнительные вещества – “ножки”, отделяющие его от носителя (пептиды, диамины, полиамины, олигосахариды). Как и носитель, “ножка” должна быть инертной и не влиять на процессы в ходе аффинной хроматографии, чего, однако, не всегда удается достигнуть.

    Лигандами могут служить субстраты, но, как правило, применяют их аналоги, устойчивые к дальнейшему превращению, т.е. ингибиторы ферментов. Эффективны природные ингибиторы ферментов, например, пепстатин – ингибитор аспартильных протеиназ. Иногда применяют лиганды, связывающие большие группы родственных ферментов (в частности, киназы и дегидрогеназы).

    Известны лиганды (например, производные фенилборной кислоты), имитирующие при взаимодействии с ферментом структуру переходного комплекса с субстратом. Такие лиганды эффективны при выделении сериновых гидролаз.

    Выбор адсорбента

    Матрица является инертным носителем, с которым лиганд может быть ковалентно и не ковалентно связан. Ниже перечислены основные свойства хроматографических матриц:
    Чрезвычайно низкая неспецифическая адсорбция;
  • гидроксильные группы углеводных остатков идеально подходят для ковалентного связывания аффинных лигандов;
  • Открытая пористая структура, обеспечивающая высокую связывающую способность даже для больших биомолекул;
  • Стабильность в диапазоне условий эксперимента, таких как высокий и низкий рН, детергенты и т.д.
    Наиболее часто используют: сефарозу 4В, CL и аффи-гель, а также силикагель, стекло, органические полимеры.




    3. Подвижная фаза в аффинной хроматографии

    Подвижная фаза аффинной хроматографии должна элюировать анализируемые соединения с оптимальными значениями k'1
    Если компоненты разделяемой смеси имеют близкие значения k', хроматографируют одним элюентом (изократический режим), если отдельные компоненты смеси сильно удерживаются сорбентом, используют серию элюентов возрастающей силы (ступенчатое или непрерывное градиентное элюирование).





    4. Анализируемые вещества в аффинной хроматографии
    Методом аффинной хроматографии можно выделять ферменты, иммуноглобулины, рекомбинантные белки содержащие метку, ДНК-связывающие белки, а также токсины, ингибиторы, транспортные белки и другие биологически активные вещества, также аффинным методом возможны чистка или удаление сериновых протеаз.
    5. Принцип действия аффинной хроматографии, с какими точностью и чувствительностью возможно определять состав смеси
    Механизм разделения в аффинной хроматографии схематически представлен на рис.4

    Рис. 4. Механизм разделения веществ в аффинной хроматографии:

    а – иммобилизация лиганда (ковалентно);

    б – связывание целевого вещества (нековалентно) и удаление сопутствующих примесей;

    в – десорбция целевого вещества

    Лиганд L фиксирован на матрице, целевое вещество S связывается с лигандом и вследствие этого извлекается из раствора.

    На стадии элюирования комплекс разрушается и целевое вещество вновь переходит в раствор. Разделение основано на равновесной реакции: L + S ⇔ K, где K – комплекс.
    Взаимодействие вещество – лиганд должно быть специфическим и обратимым. Характеристикой обратимости процесса является константа диссоциации. Данные по константе диссоциации можно брать из литературных источников.
    Лиганд должен иметь реакционноспособные функциональные группы, при помощи которых осуществляется его связь с матрицей, при этом должна сохраняться биоспецифическая активность лиганда. Если лиганд имеет несколько таких групп, его иммобилизация должна проводиться с участием той из них, которая не входит в участок, взаимодействующий с целевым веществом.
    Разделение компонентов в аффинной рабочий раствор, содержащий вещество, которое необходимо выделить, пропускают через сорбент;
  • лиганд, нанесенный на матрицу-сорбент, удерживает это вещество;
  • происходит его концентрирование (накопление);
  • извлечение выделенного вещества с сорбента при помощи вымывания растворителем.


    Хроматографические носители могут быть функционализированы определенными молекулами, которые специфически связывают белки с метками.
    Разделение в аффинной
    Когда сложная белковая смесь проходит через функционализированный носитель, то белок с меткой связывается с носителем, a все остальные белки выходят из колонки.
    Или же иногда разделяемую смесь помещают в Затем Точность и чувствительность
    Метод аффинной хроматографии обладает высокой биоселективностью и, следовательно, дает высокую точность и чувствительность, при этом смесь веществ может быть очищена в несколько тысяч раз.
    6. Необходимое оборудование для аффинной хроматографии
    Оборудование для аффинной хроматографии включает в свой состав следующие основные узлы:
    емкости-накопители для подвижной фазы (элюента);
  • насосы высокого давления для подачи среды (чаще всего поршневые);
  • фильтр для очистки элюентов от пыли;
  • дозирующее устройство;
  • хроматографическая колонна для разделения смеси;
  • детектор для определения разделенных компонентов, выходящих из колонны;
  • регистраторы хроматограмм и микропроцессорный блок (ЭВМ).

    С целью уменьшения количества растворенного воздуха через подвижную фазу предварительно пропускают гелий.

    Для изменения концентрации элюента устанавливают несколько насосов, управляемых программатором.
    Хроматографические колонны изготавливаются из нержавеющей стали (при повышенных требованиях к коррозионной устойчивости), из стекла (универсальный вариант) или из акрила. Для препаративных целей их диаметр может колебаться от 2 до 70 см. В аналитической хроматографии применяют микроколонки Ø10-150 мкм.
    Для повышения чувствительности детекторов в смесь вводятся реагенты, которые способствуют образованию веществ, которые больше поглощают лучи в ультрафиолетовой или видимой области спектра.
    7. Применение
    Аффинная хроматография используется для выделения следующих видов веществ (в скобках указан вид применяемого при этом лиганда):
    аналоги ферментативных ингибиторов, субстратов и кофакторов (ферменты);
  • высокомолекулярные углеводы, полимеры моносахаридов, гликопротеины (лектины);
  • ядерные белки, нуклеотидилтрансферазы (нуклеиновые кислоты);
  • рецепторы, транспортные белки (витамины, гормоны);
  • белки, взаимодействующие с клеточными мембранами (клетки)
  • биоорганические вещества, обладающие признаками генетической чужеродности, вирусы и клетки (антитела).

    Эта технология также используется для получения иммобилизованных ферментов, а привязка их к целлюлозе позволяет изготовить иммуносорбенты.
    Ссылки:

  •  Фактор удерживания (коэффициент емкости), k' – один из основополагающих параметров удерживания в жидкостной хроматографии, безразмерная величина, характеризующая удерживание вещества и равная отношению абсолютного объема удерживания к свободному объему колонки

    k’ = V
    a также отношению приведенного времени удерживания к мертвому времени k’=t


    перейти в каталог файлов


  • связь с админом