Главная страница
qrcode

Г.Д. Отинов_Лизоцим. Министерство образование и науки Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное


Скачать 374.48 Kb.
НазваниеМинистерство образование и науки Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное
Дата03.08.2019
Размер374.48 Kb.
Формат файлаdocx
Имя файлаГ.Д. Отинов_Лизоцим.docx
ТипРеферат
#36997
Каталог

Министерство образование и науки Российской Федерации

Федеральное государственное бюджетное

образовательное учреждение высшего образования «Пермский национальный исследовательский политехнический университет»

Химико-технологический факультет,

кафедра «Химии и биотехнологии»

Направление 19.03.01 – Биотехнология

Индивидуальное задание

по предмету технология ферментных препаратов

«Лизоцим»

Выполнил студент

гр. БТ-15-1б Г.Д. Отинов

Проверил:
к.х.н., доц. А.В. Портнова


Пермь, 2019г.

Содержание













1 Введение


Лизоцим – антимикробный катионный пептид (рис.1) [1] с высокой ферментативной активностью, является пептидогликангидролазой, активирует неспецифический иммунитет. И как следствие он имеет широкое применение в пищевой и фармацевтической промышленности в качестве антимикробного агента, также ген отвечающий за синтез человеческого лизоцима часто используют для генной модификации крупного рогатого скота [2].

Такой пептид содержится как у животных, так и у растений. Несмотря на это чаще всего коммерческий препарат лизоцима производится из яичного белка [3].


А Б

Рис. 1 Структура лизоцима яичного белка (А) [1] и

структура лизоцима человека (Б) [3]

Основными недостатками лизоцима полученного из яичного белка это высокая стоимость, низкая активность и ко всему этому иммунобиологические отторжение у некоторых людей. Основным направлением решения этой проблемы явилось микробное производство этого фермента, также микроорганизмы могут является генетически модифицированными [2]. Лизоцим является активным веществом таких препаратов как: гексализ, лизак, лисобакт, алтавим (препарат используется в сельском хозяйстве)

2 Источники лизоцима


Выше сказано, что основным коммерческим способом получения лизоцима является его выработка из яичного белка, но на ряду с этим существует и другие источники этого пептида:
Растительные: папая, репа, каучуковое дерево и ячмень
  • Микробные: Arthrobacter crystalopoites, Bacillus subtilis, Bacillus thuringensis, Enterococcus hirae и Streptomyces griseus.
    Что касается особенностей лизоцима человека. Он обладает более выраженной гидролитической активностью по отношению к клеточной стенке бактерий в свою очередь производство человеческого лизоцима является приоритетным т.к. лизоцим яичного белка лишь на 60% идентичен с человеческим, что приводит к различному иммунному ответу. Необходимо отметить, что ферментативная активность человеческого лизоцима в 4 раза выше, чем лизоцима, полученного из яичного белка.

    Производство лизоцима человека основывается на методах генной инженерии микроорганизмов [2].

    3 Методы получения лизоцима

    3.1 Продукция лизоцима из яичного белка


    Классический метод получения лизоцима включает в себя повторную кристаллизацию фермента добавления 5% р-ра NaCl при кислотности среды 9,5 в куриный белок. Проведение такого процесса может занять около 7 суток. После подобного процесса получения лизоцима он теряет свою активность на 20-40% [4].

    Таким образом блок-схему для процесса получение фремента при помощи 5% раствора NaCl в щелочной pH можно представить в следующем виде (рис.2):


    Рис. 2 Технологическая схема производства лизоцима яичного белка выссаливанием

    Также существует способ получения лизоцима путем контакта яичного белка с слабокислой ионообменной смолой Duolite C-464 предложенный Ли Ченом и соавт. 1986 (рис.3). На первой этапе элюирования смолы солевым раствором, загрязняющие белки удаляются, после чего происходил процесс ступенчатого элюирования натрий фосфатным буфером (0,1 М pH 7,5-8,3) с 0,15 М NaCl для выхода лизоцима. Основным отходов такого производства является белок яичный после извлечения лизоцима [5].

    Методы определения активности полученного препарата:
    Вискозиметрический анализ. Определение вязкости в течение процесса деструкции пептидогликана; [6]
  • Определение изменения величины помутнения клеточных стенок убитых кипячением бактерий M. lysodekticus после добавления лизоцима; [7]
  • Измерение скорости лизиса лиофилизированных бактерий M. Lysodekticus, где скорость будет соответствовать единицам активности лизоцима. [8]

    Рис. 3 Технологическая схема получения лизоцима яичного белка при помощи катионнообменной смолы Duolite C-464

    Важно отметить, что отход производства лизоцима яичного белка при помощи катионнообменной смолы Duolite C-464 является фактически чистый яичный белок без лизоцима, который в дальнейшем может использоваться в других отраслях (согласно [5])


    3.2 Продукция лизоцима человека модифицированным штаммом E.coli

    Согласно [2] (рис.4) и что стоимость 1 г лизоцима куриного белка 2,05 $, стоимость производства $ 0,02/ 25000 U, в свою очередь стоимость 1 г лизоцима человека 2,19 $, стоимость производства $ 1,26/ 25000 U [2].


    Рис. 4 Способность к продукции лизоцима человека и яичного белка модифицированными штаммами микроорганизмов

    Видно, что величина выхода продуктов довольно высокая, что является несомненный плюсом. Если же рассматривать подробно схему получения препарата (рис.5) модифицированным штаммом E.coli. Видно, что схема получения такого препарата является сложной и требующая наличия дорого оборудования, что также приводит к увеличению стоимости такого препарата [10].


    Рис. 5. Получение лизоцима человека с использованием модифицированного штамма E.coli

    Несомненными положительными сторонами процесса получения лизоцима человека из микроорганизмов является их широкая функциональность и скорость по сравнению с другим методом, а также доступность этих микроорганизмов [2,10].

    3.3 Оптимизации процессов получения лизоцима


    Оптимизация условий для получения лизоцима методом выссаливания может явиться преодолении его основного минуса процесса, которым является, то что не происходит очистки от других белков в содержащихся в яичном белке. Процесс сепарации возможно произвести путем растворения кристаллов фермента в водном или буферном растворе с последующей очисткой на фенильных смолах.

    Для модернизации метода предложенного Ченом и соавт. 1986 Рязанов Е.М. и Островский Д.И. [10] предложили следующий метод: я



    Основными методами контроля процессов могут быть микробиологический контроль на первой стадии получения лизоцима из яичного белка. Строгий контроль диапазона pH для процесса десорбции лизоцима с носителя [10]. К примеру, контроль pH осуществляется на этапе элюирования препарата в реакторе.

    Для процесса культивирования микроорганизмов в методе представленном в [11] требуется анализ частоты культуры, температуры, pH, величины оптической плотности, которые преимущественно при малых объемах выполняются путем отбора пробы и дальнейшего анализа на специальном оборудовании, к примеру на спектрофотометре PD-303 («Apel», Япония), pH метре для лабораторного и промышленного производства, постановка количества колониеобразующих единиц (КОЕ/мл). Каждый из этих параметров детерминируется на протяжении всего процесса культивирования.

    Для оценки активности фермента могут применяются вышеописанные методы. Оценка чистоты фермента может производств путем высокоэффективной жидкостной хроматографии [11] или каких-либо других, подходящих под целевой продукт.

    4 Техника безопасности и охрана труда


    Для обеспечения охраны труды на предприятиях, которые занимаются производством лизоцима при помощи микроорганизмов прежде всего необходим Нормы охраны поверхностных вод от загрязнения

    5 Заключение
    Применение модифицированного штамма E.coliявляется, возможно, одним из основных приоритетных направлении развития. Т.к. модификация микроорганизмов является во много раз удобнее, чем модификация каких-либо растений, к примеру риса [2], необходимо отметить и разницу в масштабах процесса культивирования [10]. Также как уже было сказано выше наиболее приоритетным видом лизоцима на данный момент является человеческий. Также стоит обратить внимание на момент взаимодействия рынков птицеводства и производства лизоцима.


    Список литературы

      National Center for Biotechnology Information. PubChem Database. CID=16130991, https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/16130991 (accessed on Apr. 12, 2019)
    1. Naudi AS. (2000). Natural food antimicrobial system. New York (NY): CRC press.
    2. ГОСТ Р 57475-2017. Белок яичный сухой после извлечения лизоцима. Технические условия.
    3. Meyer K, Hahnel E. (1946). The estimation of lysozyme by a viscosimetric method. J Biol Chem, 163, 732 – 32
    4. Gupta D.K, Figura K.Von., Hasilik A. (1987). Conditions for areliable application of lysoplate method in the determination of lysozyme. Clinica Chimica Acta, 165, 73-82.
    5. Richard M.P., Ramesh C.C., Khem M.S. (1965). A rapid and sensitive assay of muramidase. Proc Soc Exp Biol Med, 119, 384-386.
    6. Рязанов Е.М., Островский Д.И. Способ получения лизоцима из яичного белка [Электронный ресурс] // FindPatent.ru – способы получения лизоцима. – Режим доступа: http://www.findpatent.ru/byauthors/521033/. Доступ свободный. [13.04.2019]
    7. Lamppa J.W., Tanyos S.A., Griswold K.E. (2013). Engineering Escherichia coli for soluble expression and single step purification of active human lysozyme. J Biotechnol, 164, 1-8.
    8. ГОСТ 505713. 94. Требования по обеспечению безопасности. Защита от поражения электрическим током.
    9. СанПиН 4630-88. Санитарные Правила и Нормы охраны поверхностных вод от загрязнения

      перейти в каталог файлов


  • связь с админом